Альтернативные бороновые кислоты при обнаружении миколактона А/В методом тонкослойной хроматографии (f

BMC Инфекционные болезни, том 23, Номер статьи: 495 (2023 г.) Цитировать эту статью

321 Доступ

8 Альтметрика

Подробности о метриках

Возбудителем язвы Бурули является Mycobacterium Nuclearans. Патологию заболевания, вызванного M. Nuclearans, связывают с секрецией мощного макролидного цитотоксина, известного как миколактон, который играет важную роль в вирулентности заболевания. Миколактон является биомаркером для диагностики ЯБ, который можно обнаружить с помощью метода флуоресцентной тонкослойной хроматографии (f-TLC). Этот метод основан на химической дериватизации миколактона A/B с помощью 2-нафтилбороновой кислоты (BA), которая действует как флуорогенный хемосенсор. Однако фоновые помехи из-за совместно экстрагированных липидов тканей человека, особенно с клиническими образцами, в сочетании с субъективностью метода требуют исследования с целью поиска альтернативы БА.

Двадцать шесть коммерчески доступных арилбороновых кислот первоначально были проверены в качестве альтернативы БА с использованием эксперимента f-TLC. Также были проведены измерения в УФ-видимой области спектра для определения спектров максимума поглощения миколактона A/B и аддуктов микобороновой кислоты с последующим исследованием способности к усилению флуоресценции образования боронатного эфира между миколактоном A/B и тремя нашими наиболее многообещающими бороновыми кислотами. кислоты (ВА15, ВА18 и ВА21). Методика ЖХ-МС использовалась для подтверждения образования аддукта между миколактоном и бороновыми кислотами. Кроме того, было проведено сравнительное исследование между BA18 и BA с использованием образцов пациентов с BU, подтвержденных 6-полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

Три бороновые кислоты (BA15, BA18 и BA21) давали интенсивность флуоресцентных полос, превосходящую BA. Исследования комплексообразования, проведенные с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием 0,1 М раствора трех бороновых кислот и различных объемов 10 нг/мкл синтетического миколактона в диапазоне от 1 мкл до 9 мкл, соответствующих 10 нг–90 нг, дали аналогичные результаты с мико- Аддукт BA18 проявляется с наиболее заметно интенсивными полосами флуоресценции. Максимумы УФ-видимого поглощения (λmax) для свободного миколактона A/B наблюдались при 362 нм, а значения для аддуктов myco-BA15, myco-BA18 и myco-BA21 были при 272 нм, 270 нм и 286 нм. соответственно. Сопоставимое экспериментальное значение λmax, равное 362 нм для миколактона A/B, с расчетным значением Вудворда-Физера, равным 367 нм для боковой цепи жирных кислот миколактона A/B, демонстрирует, что даже несмотря на то, что образовались 2 циклических бороната, только боронат южной стороны цепь с хромофором возбуждалась облучением при 365 нм. Эксперименты по флуоресценции показали, что сочетание BA18 с миколактоном A/B вдоль 1,3-диолов заметно увеличивает интенсивность флуоресценции при 537 нм. Масс-спектрометр высокого разрешения (HR-MS) использовали для подтверждения образования аддукта myco-BA15. Наконец, анализ f-TLC образцов пациентов с BA18 показал улучшенную интенсивность аддукта BA18 по сравнению с исходным аддуктом BA.

Двадцать шесть коммерчески доступных бороновых кислот были исследованы в качестве альтернативы БА, используемой в анализе ф-ТСХ для диагностики ЯБ. Три (3) из них BA15, BA18 и BA21 показали превосходные профили интенсивности полос флуоресценции. Они предоставили профили, которые было легче интерпретировать после образования аддукта микобороновой кислоты, а в экспериментах с клиническими образцами от пациентов с BA18 они оказались лучшими. Таким образом, BA18 был идентифицирован как потенциальная альтернатива BA и может обеспечить решение проблемы фонового вмешательства совместно экстрагированных липидов тканей человека из клинических образцов, которые в настоящее время связаны с использованием BA.

Отчеты экспертной оценки

Возбудителем язвы Бурули (ЯБ) является миколактон (МЛ) – первый макролидный цитотоксин, который, как известно, продуцируется человеческим возбудителем Mycobacterium Ulcerans (MU) [1, 2]. Это единственный макролид, идентифицированный в роде Mycobacterium [3]. В 1965 году Коннор и его коллеги выдвинули гипотезу, что M.ulcerans ответственна за выработку диффузионного цитотоксина, что впоследствии было подтверждено на морских свинках. Введение фильтратов культуры микобактерий экспериментальному животному приводило к некрозу, подобному некрозу человека [4,5,6]. Предполагаемая молекула была позже эффективно выделена, очищена и охарактеризована из растворимой в ацетоне части липидных экстрактов M.ulcerans в 1999 году Джорджем и соавт. Химическая структура впоследствии была расшифрована как поликетид, названный миколактоном (ML) [7, 8]. МЛ выявляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в виде светло-желтой, УФ-активной липидной полосы со значением фактора удерживания 0,23 в смеси хлороформ/метанол/вода (90:10:1, об/об/об) [7]. Заметный пик при m/z 765, соответствующий натриевому аддукту миколактона, наблюдался с помощью масс-спектрометрического (МС) анализа в условиях электрораспыления. ML представляет собой гибридный поликетидный макролид с 12-членным лактоновым кольцом в ядре, а также C5-O-связанной полиненасыщенной ацильной боковой цепью, пронумерованной C1'-C16' на юге, и C-связанной верхней боковой цепью, состоящей из атомы углерода С12–С20. Различные конгенеры миколактона возникают в результате различий в «южной» цепи, тогда как верхняя «северная» цепь инвариантна. Дальнейшие исследования показали, что миколактон, полученный из M.ulcerans, представляет собой комбинацию 3:2 двух стереоизомеров, известных как миколактоны A и B, которые образуются в виде спонтанных геометрических изомеров вокруг двойной связи C4' C5' (показано волнистой линией между C5' и C6') [9, 10] (рис. 1).